罗切斯特大学成立于1850年，最开始时为一个浸信会资助的学校。该校的成立源于柯盖德大学所在的美国纽约州的汉密尔顿市。1848年，浸信会教育协会（Baptist Education Society）计划将柯盖德大学搬到罗切斯特市，但由于法律诉讼被迫停止。表示反对的董事会成员，大学老师以及学生成立了罗切斯特大学，并于1850年1月31日从纽约州大学委员会得到了授权。同年11月份，罗切斯特大学开课，一开始共有大概60名学生。
罗切斯特大学最开始就在位于罗切斯特市区布法罗大街上的美国酒店（United States Hotel）里。1853年，校区东移至当时的郊区，现在的大学街（University Avenue）上。当地商人与国会议员Azariah Boody为新校区捐赠了8英亩的土地，后来学校又从他手中购买了17英亩的土地来建造新校区。罗切斯特大学一直保留并使用着这个校区，直到现在的River Campus校区于1930年建成，这之后，学校继续拥有一小部分大学街上的校区（学校所有的艺术纪念展览馆所在地）。
在苏珊·安东尼以及Helen Barrett Montgomery的女权运动努力下，该校于1900年接收了第一批女学生。在19世纪90年代，一些女性学生曾以“访问者”的身份在该校上课以及研究，但是她们并不算是正式登记的学生，她们的记录也没有包括在学校的登记册里。校长David Jayne Hill允许第一位女学生Helen E. Wilkinson正式登记成为一名普通学生，但是她也没能被允许正式录取以及获取学位。直到1900年，33位女性学生才成为该校的正式学生，她们之中Ella S. Wilcoxen于1901年正式获得了学位。当River Campus于1930年建成后，男生被先转到新校区，而女生们则一直在University Avenue校区继续上课至1955年。
学校的主要发展出现在1900-1935年，学校的第三任校长Rush Rhees在职期间。在这期间，柯达公司的创办人乔治·伊士曼捐赠了超过5千万美元，成为学校的主要捐赠者。学校于1925年授初的第一个哲学博士学位。1955年，原先的男女分院正式合并为一个艺术科学及工程学院（University of Rochester College of Arts Sciences and Engineering）。1958年，学校成立了工程、工商管理以及教育三个新的学院。
1995年，学校第九任校长Thomas H. Jackson宣布了一项“复兴计划”，包括有缩减招生人数与制定更严格的招生审核流程。这个计划也修改了本科课程设置，并一直延续到现在。
